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二硫苏糖醇DTT的基本调制操作步骤

 发布时间:2022-08-12 点击量:73
 二硫苏糖醇DTT是一种很强的还原剂,其还原性很大程度上是由于其氧化状态六元环(含二硫键)的构象稳定性。它的氧化还原电势在pH为7时为-0.33伏。二硫苏糖醇DTT常常被用于蛋白质中双硫键的还原,可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间双硫键。  
(1)制备0.2mol/LDTT  
在实验室通风橱内称量DTT;向锥形瓶内加入1gDTT和32mLPBS(pH8.0)混合均匀  
在1mL试管上标示批号、有效期和“0.2mol/LDTT”  
在每个EP管中加入约500uL0.2mol/LDTT,储存温度≤18℃。  
(2)处理红细胞  
如果为冷冻状态,则在室温将0.2mol/LDTT解冻,每份需处理的细胞都需1小瓶冷冻DTT,使用相同批号的DTT,解冻后混合均匀。  
选择试剂红细胞用作对照;阳性对照细胞为E+(或E+e+或E+e-),阴性对照细胞为K+(或K+k+或K+k-)  
针对每份拟检测的抗筛细胞或谱细胞,以及自身对照和对照细胞,取1个10mm×75mm试管并标示以下内容:患者标本号、“DTT”、细胞的编号、“自身对照”、“阳性对照”或“阴性对照”  
向每个试管中分别加入1倍体积(如2滴)3%~5%适当悬浮红细胞  
使用PBS(pH7.3)洗涤每个试管,总共洗涤4次  
向每个试管中加入4倍体积(如8滴)0.2mol/LDTT  
混合均匀并在37℃下孵育30min(≤45min)  
在孵育期间,通过倒置3~4次轻轻混合  
使用PBS(pH7.3)洗涤每个试管中的细胞,总共洗涤4次  
(3)检测对照细胞  
依照常规规程检测对照细胞的抗原类型E和K  
该细胞必须检测为E阳性且K阴性,才可证明DTT处理方法有效;如果抗原类型检测结果不符合预期的要求,则必须重复整个检测步骤  
(4)将DTT处理后的红细胞,按实验室常规流程做相关检测(如抗体筛查试验或交叉配血试验等)
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